Le strategie di sequenziamento di nuova generazione (Next Generation Sequencing, NGS) nella diagnosi di malattie rare complesse ed eterogenee si configurano come uno strumento sempre più importante.
Il laboratorio di genetica MAGI, con sede in Trentino, ha potuto intraprendere uno studio volto a valutarne le potenzialità. Negli ultimi anni, le tecnologie NGS hanno fornito un grande contributo nel campo della diagnosi delle malattie genetiche rare in termini di riconoscimento dei geni coinvolti e delle mutazioni causative. I metodi di NGS permettono infatti di analizzare contemporaneamente un numero elevato di geni in più pazienti, in modo più rapido ed economico rispetto alle tecniche di sequenziamento convenzionale (sequenziamento diretto).
In un simile contesto, negli ultimi anni, il dott. Bertelli – direttore del Laboratorio MAGI - ha compreso l’importanza di testare il potenziale delle tecnologie di nuova generazione in ambito diagnostico. La formazione del personale MAGI, necessaria per l’utilizzo delle strategie NGS (in particolare della tecnologia Illumina), è stata ottenuta grazie alla partecipazione a diversi corsi ad hoc organizzati presso centri e strutture specializzate, come il Laboratorio di Genetica molecolare dell’Azienda Ospedaliera Papa Giovanni XXIII di Bergamo guidato dalla dott.ssa Maria Iascone, nonché alla stretta collaborazione istituita con enti esteri come il Dipartimento di Fisiopatologia della Retina dell’ INSERM di Parigi. Il lavoro è stato anche seguito da una laureanda in Biotecnologie farmaceutiche dell’Università di Bologna, trentina DOC, la Dr.ssa Silvia Tezzele, che ha sviluppato la stesura della tesi di Laurea presso il laboratorio stesso, inserendo la giovane proprio nel progetto sul NGS.
Per testare le potenzialità delle tecnologie NGS nel campo della ricerca e della diagnostica, il laboratorio MAGI ha quindi progettato e testato nel corso dell’anno 2013 alcuni pannelli genici per analizzare il DNA di diversi pazienti affetti da distrofie retiniche, malformazioni vascolari e linfedema. In tal modo, MAGI ha messo a punto un test genetico che offre la miglior strategia diagnostica in grado di garantire maggiori benefici ai pazienti e, allo stesso tempo, comportando i minori costi.
Lo studio NGS sulle distrofie retiniche ha previsto l’ utilizzo di un pannello di più di 100 geni che - in base alla letteratura - sono più frequentemente associabili alle patologie della retina, ed ha coinvolto oltre 100 pazienti afferenti ai dipartimenti di clinica oculistica degli Ospedali “San Paolo”, “L. Sacco” e della Fondazione IRCCS Ca' Granda (Ospedale Maggiore Policlinico) di Milano. Il protocollo NGS e l’analisi mediante tecnologia Illumina sono stati effettuati in collaborazione con il dipartimento di fisiopatologia della retina del centro INSERM di Parigi (dott.ssa Isabelle Audo, dott.ssa Christina Zeitz, dott. Said El Shamieh).
L’approccio NGS utilizzato in questo studio sulla retina ha permesso di rilevare le possibili alterazioni causative nella maggior parte dei pazienti valutati, raggiungendo un tasso di positività diagnostica superiore al 60%; si tratta di un risultato molto significativo considerando che, in passato, con metodiche tradizionali la positività dei test difficilmente superava il 30%.
Uno studio analogo è inoltre stato effettuato per altre due patologie su cui è focalizzata l’ attività diagnostica e di ricerca di MAGI, ovvero le malformazioni vascolari (MAV) ed il linfedema ereditario. La complessità che caratterizza tali patologie risiede nel fatto che si tratta di disordini multigenici ancora poco studiati, spesso associati a spettri fenotipici sovrapposti , e per i quali è oramai chiaro che esistono molti geni responsabili non ancora noti; è quindi proprio questa complessità a rendere difficoltosa la diagnosi molecolare con metodiche tradizionali (positività inferiore al 10%).
Il laboratorio MAGI ha stretto una forte collaborazione con il professor Raul Mattassi, direttore del Dipartimento di Angiologia e Chirurgia Vascolare della Clinica Humanitas Mater Domini di Castellanza (Varese) ed il professor Sandro Michelini, presidente della Società Europea di Linfologia e responsabile dell'Unità Operativa Riabilitazione Vascolare del San Giovanni Battista di Roma, nonché uno dei massimi esperti in assoluto sulla ricerca e la terapia del linfedema. Nello studio NGS sono stati coinvolti circa 150 pazienti; anche in questo caso, i dati relativi al tasso di positività diagnostica sono migliorati rispetto a quelli ottenuti con sequenziamento diretto, seppur in misura inferiore rispetto alle distrofie retiniche.
I risultati ottenuti dall’esperimento NGS sono stati utilizzati per effettuare una statistica sulla frequenza di mutazione dei geni presi in considerazione e progettare quindi una nuova strategia diagnostica basata sulla generazione – sia per le distrofie retiniche che per le MAV - di 2 distinti pannelli di geni: uno utilizzabile per primo per l’analisi di tutti i campioni, caratterizzato da un numero ristretto di geni comprendenti quelli maggiormente colpiti; l’altro di maggiori dimensioni, riservato ai casi risultati negativi alla prima analisi. Tutto questo permetterebbe di aumentare considerevolmente la probabilità di identificare le mutazioni responsabili delle malattie genetiche e fornire quindi ai pazienti una risposta in tempi più rapidi. La caratterizzazione del difetto genetico non è rilevante solo per la comprensione della patologia, ma risulta cruciale per la consulenza genetica del paziente e dei suoi familiari e, soprattutto, costituisce un prerequisito essenziale per qualsiasi forma di approccio terapeutico.
I dati generati da questo progetto sono in corso di pubblicazione su riviste scientifiche.