Il prof. Alberto Auricchio (Napoli) illustra i grandi progetti di ricerca europei volti a correggere i difetti retinici ereditari

La retina è uno dei componenti chiave dell’occhio perché formata in prevalenza da strati di fotorecettori, cellule pigmentate, suddivise in coni e bastoncelli, che ricevono gli stimoli visivi e li trasmettono, attraverso il nervo ottico, al cervello. La capacità di visione, così come noi la intendiamo, si realizza grazie alla retina: pertanto, le patologie dell’occhio che la riguardano, oltre ad essere tra le più note, rappresentano un fondamentale campo d’indagine per i ricercatori. Ciò trova conferma nel numero e nella qualità dei progetti di terapia genica promossi in Europa nel corso degli ultimi anni.

“AAVEye è stato il primo di questi progetti ad essere finanziato: era un programma del 2008 con il quale sono stati messi a punto i vettori virali grazie a cui trasferire geni alla retina in modelli animali”, spiega Alberto Auricchio, professore di Genetica Medica presso l’Università “Federico II” di Napoli e coordinatore del programma di ricerca Terapie Molecolari dell’Istituto Telethon di Genetica e Medicina (Tigem) di Napoli. “Tra gli istituti coinvolti, oltre al Tigem, figuravano laboratori in Inghilterra, Svizzera e Francia, uniti in un’ampia ricerca pre-clinica su malattie come la retinite pigmentosa e l’amaurosi congenita di Leber”. 

Molte delle malattie retiniche che implicano la degenerazione dei fotorecettori sono causate da mutazioni genetiche conosciute: ad esempio, per quanto riguarda la retinite pigmentosa, tra le mutazioni identificate ci sono quelle relative al gene PDE6B che, insieme alle anomalie del gene AIPL1, alla base dell’amaurosi congenita di Leber, sono state il perno del progetto AAVEye, il cui primo obiettivo era proprio lo sviluppo di una terapia genica contro queste patologie rare. Il concetto di terapia genica prevede, essenzialmente, l’utilizzo di virus che vengono resi innocui e utilizzati come vettori, allo scopo di trasferire, in determinate cellule dell’organismo, delle copie sane del gene mutato che è all’origine di una data malattia.

“La principale ambizione di AAVEye era quella di sviluppare vettori virali adeno-associati (AAV) per portare i geni corretti sino ai fotorecettori della retina”, spiega il prof. Auricchio. “Oltre ad essere il primo bersaglio delle mutazioni che causano le retinopatie ereditarie, i fotorecettori sono cellule particolarmente difficili da raggiungere con i vettori virali, perché si trovano all’interno della retina, cosa che rende arduo ricorrere ad un’iniezione intraoculare. In questo progetto, abbiamo selezionato vari tipi di AAV, identificando alcune varietà più efficaci di altre a far esprimere i geni corretti nei fotorecettori. L’altro obiettivo del progetto era permettere ai vettori di esprimere nei fotorecettori le proteine terapeutiche a livelli adeguati. AAVEye prevedeva dunque un aspetto tecnologico dato dalla messa a punto sia dei vari sierotipi virali, sia degli elementi regolatori per l’espressione di geni nella retina. Tali piattaforme tecnologiche sono state testate in modelli animali di retinite pigmentosa e di amaurosi congenita di Leber”.

Successivamente, in Europa è stato approvato RETGeneTx, un progetto dello European Research Council nel quale si proseguiva il lavoro iniziato con AAVEye. “Tra gli obiettivi c’era quello di risolvere uno dei problemi della piattaforma di trasferimento tecnico”, precisa Auricchio. “I vettori virali adeno-associati sono efficienti nel raggiungere il sito bersaglio sulla retina ma hanno una capienza massima di 5 chilobasi di DNA, pertanto sono piccoli e non riescono a trasportare frammenti di DNA lunghi, sollevando un problema per alcune forme di amaurosi di Leber o per la malattia di Stargardt, in cui il gene mutato appare di grosse dimensioni”. Nell’ambito di RETGeneTx, questo ostacolo è stato superato con lo sviluppo di una piattaforma “duale” grazie alla quale il gene da trasportare veniva spezzato in due segmenti di modeste dimensioni, che potevano così essere veicolati da due vettori. “Un vettore trasporta la prima metà del gene, insieme al promotore, mentre l’altro trasporta la seconda metà”, aggiunge l’esperto. “Infettando gli stessi fotorecettori con entrambi i vettori, grazie a questo sistema le due metà ricombinano, producendo un unico pezzo di DNA. Si ricostituisce così il gene originario di grosse dimensioni”. Anche in questo caso, il sistema è stato progettato e messo a punto, per poi essere infine testato su modelli animali in cui era stata riprodotta la malattia di Stargardt o l’amaurosi congenita di Leber.

Per tentare di risolvere definitivamente le limitazioni relative all’impiego della terapia genica per le patologie della retina, l’ultimo programma di ricerca approvato in Europa è EYEGet, tuttora in corso e finanziato sempre dallo European Research Council. Con EYEGet, l’approccio di espansione della capacità di carico dei virus testato in RETGeneTx è stato superato ricorrendo a ben determinate sequenze batteriche in grado di ricombinare tra di loro. “In questo caso, abbiamo preso due vettori AAV, ognuno dei quali codifica per la metà di una proteina di grosse dimensioni”, precisa l’esperto. “Entrambe le metà sono fiancheggiate da sequenze proteiche di derivazione batterica, dette inteine, le quali, quando si trovano vicine, vanno incontro a ricombinazione proteica. Trasportate da due vettori AAV diversi, esse si fondono e formano una proteina di grosse dimensioni”. Si tratta di un sistema più efficiente del precedente, perché il processo di ricombinazione, necessario per formare un unico prodotto, non avviene a monte, a livello del DNA, ma a valle, a livello di proteine.

“Un ulteriore aspetto del progetto EYEGet consiste nell’impiego di un approccio di editing del genoma”, chiarisce Auricchio. “Sfruttiamo i vettori AAV nella retina per esprimere la nucleasi batterica del sistema CRISPR, che permette di introdurre in punti specifici del genoma delle sequenze di DNA terapeutico. In questo caso, i vettori AAV trasportano sia l’enzima che taglia, sia il segmento di DNA terapeutico che viene integrato nel DNA della cellula. Questo approccio si applica alle forme dominanti di retinite pigmentosa, nelle quali la mutazione del gene per la rodopsina provoca un effetto tossico a livello dei fotorecettori. Grazie al ‘taglia e cuci’ di CRISPR, annulliamo l’effetto tossico generato dalla copia mutata del gene sostituendola con una copia corretta”. EYEGet, dunque, mescola sia approcci di terapia genica che tecniche di editing del genoma, nella speranza di migliorare in maniera sensibile la qualità di vita dei pazienti affetti da malattie della retina.

Una conferma del valore trasversale di queste ricerche giunge dall’erogazione di un finanziamento europeo per la realizzazione di una sperimentazione clinica basata sulla piattaforma “duale” messa a punto nell’ambito del progetto RETGeneTx. Grazie ai fondi del grant UshTher, infatti, saranno valutate la sicurezza e l’efficacia di un approccio di terapia terapia genica per pazienti affetti da retinite pigmentosa associata alla sindrome di Usher di tipo 1B (USH1B), permettendo così un ulteriore passo avanti verso la traduzione in clinica di strategie terapeutiche sempre più mirate per malattie ancora prive di trattamenti specifici.

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